金擔(dān)子素A(Aureobasidin A,AbA)是從絲狀真菌 Aureobasidium pullulans No. R106 中分離出來的環(huán)酯肽類抗生素,具有很強(qiáng)的抗真菌能力。AbA 作用機(jī)制是抑制酵母中 AUR1 基因(1,2)編碼的肌醇磷酰胺(inositol phosphorylceramide,IPC)合成酶的活性,干擾鞘脂合成,從而殺死菌株。AbA在較低的濃度下(0.1-0.5 μg/mL)即可對(duì)酵母產(chǎn)生毒性。編碼IPC合成酶的基因研究較多的來自釀酒酵母菌的AUR1基因,以及構(gòu)巢曲霉的AURA基因,兩者具有同源性。通過對(duì)編碼 AUR1-C基因進(jìn)行突變即可使得菌株對(duì)AbA產(chǎn)生抗性,作為蛋白質(zhì)互作研究的報(bào)告基因。
因?yàn)锳bA可以直接殺死敏感的酵母菌株,而不是延遲菌株生長,所以AbA篩選有利于陽性克隆的生長和識(shí)別。與營養(yǎng)報(bào)告基因(如 HIS3)進(jìn)行低嚴(yán)緊度初篩相比,AbA篩選大大消除了背景克隆。實(shí)際操作中,用AbA進(jìn)行初篩時(shí)會(huì)獲得更多克隆,之后再用 4 個(gè)報(bào)告子(AUR1-C,HIS3, ADE2 和 MEL1)進(jìn)行高嚴(yán)緊度的二次篩選以驗(yàn)證陽性克隆。AbA非常適合用作陽性克隆子篩選用的藥物選擇性標(biāo)記;也是酵母單/雙雜交研究中理想的報(bào)告子,可以簡化酵母雙雜交文庫篩選。MEL1和lacZ分別編碼 a-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶,可以作用于相應(yīng)的底物X-a-Gal和X-Gal使酵母變藍(lán)。其中,a-半乳糖苷酶是外分泌酶,在酵母表面就能直接檢測到;β-半乳糖苷酶是內(nèi)分泌酶,需要將酵母破碎后才能檢測到。用藍(lán)斑顯示酵母細(xì)胞內(nèi)兩個(gè)蛋白的相互作用的方法不僅具有較高的敏感性,而且藍(lán)斑的深淺還可以反映兩個(gè)蛋白相互作用的強(qiáng)弱。